وكتور نوتركيب pET-28a/ɲiC به واسطه داشتن پروموتر باكتريوفاژ T7 يك پلاسماي بياني است كه مي تواند در ميزبان مناسب خود مثل (DE3)وBL-21 و E.coli بيان گردد. براي اين منظور ابتدا ميزان بياني با كلريد كلسيم (CaCl2) مستعد (Competence) گرديد و سپس وكتور نوتركيب به درون اين ميزبان به روش شوك حرارتي ترانسفرم شد. كلوني هاي رشد كرده در محيط LB آگار حاوي كانامايسين (Kanamycin) براي تأييد حضور پلاسميدهاي نوتركيب غربالگري شدند. غربال هاي مذكور در حجم وسيعي از محيط LB broth حاي كانامايسين (حدود 400-300 ميلي ليتر) كشت داده شدند. براي القاء پروموتور وكتور نوتركيب PET-28a/ɲiC ، از IPTG (آنالوگ سنتتيك آلولاكتوز) استفاده شد. سپس از سانتريفيوژ كردن جهت Harvest كردن سلول ها استفاده شد. براي شكستن باكتري از روش ليز آنزيماتيك و ليز مكانيكي استفاده شد، بدين ترتيب كه رسوب (Pellet) باكتريايي حاصل از سانتريفيوژ در 0.2mg/ml Lysozymeو 20µg/ml DNaseو 1mM PMSFو 1mM MgCl2 حل گرديد. عمل انحلال اين تركيبات با رسوب باكتري به روش سونيكاسيون (Sonication) بر روي يخ انجام شد. لازم به ذكر است كه از روش فريز كردن - گرما دادن (freezing/thawing) نيز جهت شكستن باكتري ها استفاده شد. از روش كروماتوگرافي نيكل (Chromatography Ni) جهت تخليص پروتئين استفاده شد. بدين ترتيب كه ابتدا پروتئين هاي نوتركيب حاي هيستيدين (Histidine-tagged) كه به شكل اينكلوژن درآمده اند، بايستي حل شوند (Solubilized) كه با استفاده از 6M Guanidine - HCl يا 8M Urea اين امر محقق شد. براي اين منظور از Dcnaturing Binding Buffer استفاده شد. شستشوي اين مرحله نيز با Denaturing Wash Buffer صورت گرفت. براي اينكه پروتئين هاي حل شده عملكردشان را بازيابند، نياز به مرحله اي تحت عنوان Refolding مي باشد كه از گرادينت ايميدازول (Imidazole) براي تحقق اين امر استفاده شد. براي اين كار از بافرهاي Native Binding Bufferو Nativc Wash Buffer و Native Elusion Buffer استفاده گرديد. خلوص پروتئين تخليص شده از روش فوق، به روش SDS-PaGF و رنگ آميزي كوماسي بلو G-250 ارزيابي شد (شكل 1). در نهايت محصول كروماتوگرافي در بافر PBSو (pH:4.4) دياليز گرديد و مقدار پروتئين توليد شده از تكيك وسترن بلاتينگ (Western blotting) با استفاده از انتي بادي ضد فلاژلين نوتركيب استفاده شد (شكل 2).

باكتري Ecoli,BL-21(DE3 به عنوان يك ميزبان بياني حاوي وكتور نوتركيب pET-28alflic قادر است پروتئين فلاژلين نوتركيب سودوموناس آنروژينوزا را با وزن مولكولي 46kD توليد نمايد. در صورتي كه اين باكتري در محيط LB براث حاوي آنتي بيوتيك كانامايسين 30Mg/ml كشت داده شود و با غلظت 1mM از IPTG القاء گردد پس از انكوباسيون 4 ساعته در 37C مي تواند به ميزان زيادي فلاژلين نوتركيب را توليد نمايد. فلاژلين توليدي با ليز باكتري قابل استحصال بوده و با رزين نيكلي به شكل خالصي تخليص مي گردد. تشابه ساختار آنتي ژنيك اين پروتئين با فلاژلين طبيعي در آزمايش وسترن بلات به اثبات رسيده و آنتي بادي عليه آن قادر است در شرايط آزمايشگاهي حركت باكتري را مهار كند. بنابراين در برنامه هاي واكسيناسيون مي تواند جايگزين فرم طبيعي آن گردد.

هدف از اين اختراع طراحي و ساخت باكتري است تا با استفاده از آن بتوان مقادير قابل توجهي پروتئين نوتركيب زير واحد B ويبريو كلرا را تهيه نمود. در ابتدا DNAي ويبريو كلره به روش فنل-كلروفورم استخراج و ژن ctxB با استفاده از پرايمرهاي طراحي شده واجد سايت برش آنزيمي تكثير داده شده. سپس وكتور pET-28a از باكتري هاي واجد آن استخراج و همراه قطعه ctxB تكثير يافته هضم دوگانه با استفاده از آنزيم هاي Hind III و Xho I انجام گرفت. در ادامه وكتور و قطعه هضم شده با استفاده از آنزيم ليگار عمل ليگيشن روي آنها انجام شد تا قطعه ctxB وارد وكتور مورد نظر شود. سپس وكتور به سلول هاي DH5α ترانسفورم شده و پس از تكثير از سلول هاي مورد نظر استخراج و وارد سلول هاي بياني BL21 شد. در انتها پس از تكثير باكتري هاي نوتركيب و القا با IPTG پروتئين CTB نوتركيب بيان شد كه در ادامه با SDS-PAGE و وسترن بلاتينگ تأئيد شد.

وكتور نوتركيب pET-28alflic پلاسميدي بياني است كه در محل دو آنزيم محدود الاثر Ncoi و Xhol ژن توليد كننده فلاژلين سودوموناس آنروژينوزا flic را در خود جاي داده است اين وكتور حاوي ژن مقاومت به آنتي بيوتيك كانامايسين است كه با اضافه كردن كاتامايسين به محيط كشت باكتريايي كلون هاي دريافت كننده اين وكتور قادر به رشد خواهند بود. وكتور pET-28alflic داراي پروموتور فاز T7 است و تحت آنزيم RNA پلي مراز فاز DE3 از ژن flic رونويسي مي كند. در ناحيه c- انتهايي ژن فلاژلين اين وكتور 6 توالي هيستيديني قرار مي گيرد كه باعث تسهيل در تخليص پروتئين نوتركيب با استفاده از رزين نيكل مي گردد.

هدف از اين اختراع طراحي و ساخت وكتوري است تا با استفاده از آن بتوان مقادير قابل توجهي پروتئين نوتركيب زير واحد B سو ويبريو كلرا را تهيه نمود. در ابتدا DNA ي ويبريو كلره به روش فنل - كلروفورم استخراج و ژن ctxB با استفاده از پرايمرهاي طراحي شده واجد سايت برش آنزيمي تكثير داده شد. سپس وكتور pET-28a از باكتري هاي واجد آن استخراج و همراه قطعه ctxB تكثير يافته هضم دوگانه با استفاده از آنزيم هاي Hind IIIو XhoI انجام گرفت. در ادامه وكتور و قطعه هضم شده با استفاده از آنزيم ليگار عمل ليگيشن روي آنها انجام شد تا قطعه ctxB وارد وكتور مورد نظر شود. در انتها با انجام الكتروفورز و PCR برروي پلاسميد تهيه شده توليد پلاسميد نوتركيب تائيد شد.

نمك طعام يكي از مهمترين چاشني ها و مزه دهنده هاي غذايي است و تقريبا در تهيه كليه فراورده هاي غذايي استفاده مي شود. اما متاسفانه استفاده از نمك در رژيم هاي غذايي باعث افزايش ميزان سديم دريافتي مي شود كه مي تواند به مشكلات سلامتي بوِيژه افزايش فشارخون بيانجامد و به اين دليل توصيه مي شود كه تا جاي ممكن از مصرف بيش از اندازه نمك خودداري شود كه البته عمل به اين توصيه پزشكي و بهداشتي به راحتي ممكن نيست. از اين رو ارائه فراورده اي كه در كنار داشتن مزه شوري، مقدار سديم كمتري داشته باشد مي تواند به رعايت توصيه هاي بهداشتي كمك كند. فراورده حاصل از گياه ساليكورنيا 50 درصد سديم كمتر نسبت به نمك طعام دارد و از اين رو مي تواند در كنار تامين مزه شوري، مقدار سديم دريافتي توسط فرد را كاهش دهد و از اينرو به وضعيت سلامت فرد كمك كند. نمك هاي رژيمي مورد اشاره در اين اظهار نامه ( SaliNa و SaliNaK ) كه از منبع گياهي Salicornia تهيه و فرآوري ميشود از كلسيم بيشتر و كربوهيدرات كمتري برخوردار خواهد بود كه علاوه بر كاهش سديم (با حفظ مزه شوري) از ارزش غذايي بيشتري برخوردار بوده و حاوي كربوهيدرات كمتر مي باشد. همچنين در نمك SaliNaK به دليل اضافه كردن مقادير مجاز تركيبات پتاسيم دار به فرمولاسيون نهايي SaliNa اين نمك (SaliNaK) از نظر پتاسيم نيز غني بوده و داراي فوايد اثبات شده اين ماده معدني نيز مي باشد. يادآوري ميگردد نمك SaliNaK با اضافه كردن مقادير مجاز تركيبات پتاسيم دار به نمك SaliNa تهيه ميشود